RNA no fluxo

Em 1954, Zamecnik & Keller demonstraram que para haver síntese protéica in vitro, ou seja, num sistema livre de células, era necessária a presença dos seguintes componentes num tubo de ensaio:

  1. aminoácidos, os quais eram marcados radioativamente (14C) para serem detectados nas proteínas, após precipitação das mesmas ao término do processo de síntese;
  2. ATP, como gerador de energia;
  3. retículo endoplasmático rugoso (RER), ou seja, retículo endoplasmático acoplado a ribossomos. O RER sedimenta no fundo do tubo após centrifugação do extrato bruto celular a 100.000xg;
  4. sobrenadante de 100.000xg, onde fora detectada atividade enzimática capaz de produzir aminoácidos ativados (aminoacil-AMP).

Conclusão: a síntese proteica ocorria no citoplasma da célula, na presença de ribossomos. Assim se estabeleceu a relação entre rRNA (RNA ribossômico) e Síntese Proteica.

Apesar de, neste momento, já estar claramente demonstrado que o material genético era o DNA (Avery et al.,1944), cuja estrutura também já era conhecida, os autores não estabeleceram nenhuma conexão entre o processo citoplasmático de síntese proteica e a molécula de DNA presente no núcleo.

Pouco depois  Hoagland et al. (1958), do mesmo grupo de Zamecnick, detectaram outro tipo de RNA no sobrenadante de 100.000 x g. Este RNA passou a ser denominado RNA solúvel, em contraposição ao rRNA que sedimentava com os ribossomos. O RNA solúvel era uma molécula pequena que se ligava covalentemente aos aminoácidos ativados. Atualmente o RNA solúvel é denominado RNA transportador (tRNA).

Paulatinamente configurava-se a ideia de que o molde para a síntese proteica era RNA e não DNA, baseado em evidências tais como:

  • Existência de um tipo de RNA que transportava aminoácidos (tRNA);
  • Ocorrência de síntese proteica nos ribossomos localizados no citoplasma da célula eucariótica, portanto, separado do DNA, que se encontra no núcleo.

De início imaginou-se que a informação contida no DNA era trazida do núcleo para o citoplasma via rRNA. Mas Davern& Meselson (1960), trabalhando com E. coli, demonstraram que as moléculas de rRNA eram muito estáveis mantendo-se íntegras após várias divisões celulares. Moléculas tão estáveis e pouco variáveis, não poderiam ser responsáveis pela rápida mudança nos níveis de síntese enzimática observada nas bactérias em resposta a diferentes estímulos.

Particularmente importantes, para a compreensão do que estava acontecendo, foram os experimentos realizados no Instituto Pasteur por François Jacob, Jacques Monod e diversos colaboradores.

Cultivaram a bactéria Escherichia coli, em presença ou ausência de lactose e mediam a atividade da enzima β-galactosidaseEsta enzima degrada lactose em glicose + galactose. Células de E. coli produzem cerca de 0,5 a 5 moléculas ativas da enzima, quando cultivadas na ausência de lactose.

Ao adicionarem lactose ao meio observaram que:

bgal

  1.  a atividade de β-galactosidade, aumentava paulatina e drasticamente, nas células;
  2. o aumento de atividade dependia de síntese proteica;
  3. a síntese da enzima era induzida ~1.000 vezes;
  4. a transferência das células a um meio sem lactose, mas com glicose como fonte de carbono, implicava em parada imediata da síntese de β-galactosidase.

Dedução: uma variação tão grande e tão rápida não poderia depender de moléculas tão estáveis como os rRNAs, constituintes dos ribossomos.

Since it seems to be established that proteins are synthesized in the cytoplasm, rather than directly at the genetic level, this transfer of structural information must involve a chemical intermediate synthesized by the genes. This hypothetical intermediate we shall call the structural messenger. The rate of information transfer, i.e. of protein synthesis, may than depend either upon the activity of the gene in synthesizing the messenger, or upon the activity of the messenger in synthesizing the protein. (Jacob & Monod, 1961).

Num conjunto paralelo de experimentos adicionaram um análogo da base uracil (5-fluor-uracila) à culturas de E. coli, que estavam produzindo β-galactosidase. Quando presente no meio este análogo é incorporado em lugar de uracil durante a síntese de RNA. Observou-se, então, que a atividade de β-galactosidase produzida a partir da incorporação do análogo, caía abruptamente. Quando as células retornavam a um meio sem 5-fluor-uracila, a atividade era recuperada (Bussard et al., 1960).

Isto sugeria fortemente a existência de RNA não estável, que podia ser sintetizado e degradado rapidamente, o qual serviria de molde para a síntese da proteína. A dificuldade em se detectar tal RNA devia-se a sua alta labilidade.

Portanto, neste momento já havia evidências da existência de um RNA instável associado aos ribossomos.

Quem seria o molde para a síntese deste RNA instável?

Quando uma molécula de DNA dupla fita é desnaturada pelo calor (90oC), suas hélices se separam devido ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases. Se a solução contendo DNA desnaturado for resfriada lentamente, as duas hélices, complementares entre si, voltam a se anelar, fenômeno denominado hibridização. Ou seja, os segmentos complementares conseguem “se encontrar”, refazendo a dupla hélice. (aqui um pouco da história de híbridos DNA/RNA)

 Utilizando esta técnica Hall & Spiegelman (1961) demonstraram que o DNA agia como molde para a síntese de moléculas instáveis de RNA e que havia uma correlação entre o aumento de RNA instável e síntese proteica.

Estudavam, então, os tipos de RNAs produzidos em E. coli após infecção pelo fago T2. A bactéria infectada pelo fago T2 passa a sintetizar uma série de proteínas típicas do fago, interrompendo a síntese de suas próprias proteínas. Após algum tempo uma grande quantidade de partículas fágicas é produzida e liberada com a lise da célula bacteriana.

 dnarna hibridAo isolarem o RNA instável, recém-sintetizado, observaram que formava híbridos apenas com o DNA desnaturado de T2, e não com o DNA desnaturado de E. coli, o que fazia antes da infecção.

A existência de complementaridade RNA/DNA era uma forte indicação de que o DNA seria molde para a síntese de moléculas de RNA.

Os vários trabalhos publicados entre 1957-1961, com bactérias e seus bacteriófagos, mostravam que um intermediário instável e heterogêneo em relação ao peso molecular, o qual se associava fracamente aos ribossomos, apresentava as características desejáveis a uma molécula capaz de transferir a informação genética do DNA, seja de bactéria ou fago, até os ribossomos.

adaptador

Isto implicava, ainda,  que as máquinas produtoras de proteína serviriam tanto para a síntese de  proteína bacteriana de como proteína fágica.

 

A SEGUIR: mRNA dos GENES aos RIBOSSOMOS

Para quem gosta da história das descobertas, bom de ler: Early days of tRNA research: Discovery, function, purification and sequence analysis
UTTAM L RAJBHANDARY* and CAROLINE KÖHRER, 2006