Modos de duplicação da molécula de DNA

 

 

The New GeneticsNo trabalho publicado em 1953 descrevendo a estrutura do DNA, Watson & Crick afirmavam que o mecanismo de cópia da molécula de DNA estava implícito em sua  própria estrutura, garantindo a manutenção e a transmissão da informação genética de geração à geração:

” It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material”

Em artigo publicado logo em seguida, ainda em 1953, analisaram as implicações genéticas da estrutura do DNA, propondo que:

a) cada uma das fitas serviria de molde para a síntese de uma fita complementar;

b) a sequência dos pares de nucleotídeos nos genes constituiria informação codificada a qual seria sequencialmente traduzida para a linguagem dos aminoácidos nas proteínas.

Salientaram ainda que o passo inicial da duplicação deveria ser o desenlace das duas hélices do DNA as quais, uma vez separadas, serviriam de molde para síntese da fita complementar. Portanto, ao final do processo existiriam dois pares de cadeias onde a sequência de bases estaria exatamente duplicada, uma vez que a duplicação baseava-se no emparelhamento específico de bases (complementaridade). Sugeriram que cada novo par seria constituído de uma fita nova e uma velha, o que implicaria no modo semi-conservativo de duplicação.

Mas, de fato, de que modo as cadeias interconectadas da dupla hélice poderiam se separar? Não se sabia.

Três modos seriam possíveis:

Conservativo, Semiconservativo e Dispersivo.

dupl DNA

No modo Semiconservativo as duas fitas se desenrolariam, sem rupturas do esqueleto açúcar-fosfato e cada uma delas, separadamente, seria utilizada como molde para construir a sua complementar, de sorte que cada nova dupla seria constituída de uma fita velha e de uma nova;

O modo Conservativo seria similar ao anterior, porém as fitas novas recém sintetizadas constituiriam a nova dupla e a dupla original se manteria como tal;

No modo Dispersivo – haveria quebras continuadas na espinha-dorsal de açúcar-fosfato e subsequente reconstituição após duplicação que poderia resultar numa mistura entre segmentos velhos e novos na mesma fita.

As hipóteses  foram testadas em 1958 por Mathew Meselson & Franklin Stahl, num engenhoso experimento que permitiria distinguir um modo do outro pelo padrão de sedimentação das moléculas de DNA após ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio (CsCl).

A ultracentrifugação em uma solução de cloreto de césio (1,7 a 1,8 g/mL) permite separar moléculas de DNA com densidades levemente diferentes, porque nesta concentração a densidade do sal é semelhante à do DNA. O objetivo era distinguir as moléculas de DNA, antes e depois da duplicação, por pequenas diferenças de densidade entre elas. As moléculas se concentrariam na região do gradiente correspondente a sua própria densidade, formando bandas em diferentes posições do tubo. As bandas poderiam ser detectadas com luz ultravioleta no comprimento de onda de 260nm, onde os ácidos nucleicos absorvem fortemente.

Mas, se o processo de duplicação do DNA gera uma dupla hélice idêntica à original, qual o truque utilizado para que moléculas de DNA de mesma origem tivessem densidades diferentes antes e depois da duplicação?

É aí que entra o engenho, a arte e o conhecimento científico.

Cultivaram células de E. coli em um meio contendo o isótopo pesado de nitrogênio (15N) na forma de 15NH4Cl. O átomo de 15N contem 8 neutrons, enquanto que o do 14N contem 7, daí porque o 15N é considerado pesado. Atenção, o 15N  não é radioativo.

Após várias gerações todas as moléculas sintetizadas naquela população de bactérias, tinham incorporado 15N. Ao mesmo tempo cultivaram células em meio contendo o isótopo leve de nitrogênio 14NH4Cl, durante várias gerações.

Extrairam o DNA das células cultivadas tanto em 15NH4Cl  como em 14NH4Cl e submeteram as duas soluções de DNA à ultracentrifugação em CsCl. No tubo surgiram duas bandas: o DNA “pesado” sedimentou mais ao fundo e o DNA mais leve, mais no topo.

dna 14_15 (3)Uma vez verificado que era possível distinguir perfeitamente, no gradiente, moléculas pesadas (que incorporaram 15N), de moléculas leves (que incorpo-raram 14N), fizeram o seguinte experimento:

Transferiram células crescidas com o isótopo pesado para um meio contendo o isótopo leve e permitiram a duplicação de mais duas gerações.

Todavia, no intervalo de tempo correspondente à 1a geração, coletaram porções das células e extraíram o DNA. No intervalo de tempo correspondente à 2a geração, repetiram o procedimento.

As amostras de DNA isolados nos diferentes tempos foram ultra centrifugadas a 40.000 rotações por minuto (RPM), durante 20 horas, tempo suficiente para “encontrarem” sua posição no tubo de centrífuga, ou seja, onde sua densidade correspondesse à da solução de CsCl.

O que se poderia prever, após a primeira geração, considerando-se as três hipóteses do modo de replicação?

  • Se a duplicação fosse conservativa, haveria duas bandas, uma pesada a outra leve;
  • Se a duplicação fosse semiconservativa ou dispersiva, haveria uma única banda em posição intermediária entre a leve e a pesada.

Após a segunda geração: meselson stahl sed (2)No modo conservativo, continuariam aparecendo duas bandas (leve e pesada) sendo que a banda leve estaria mais espessa. No semiconservativo surgiriam duas bandas, uma na posição intermediária e outra na posição mais leve.No modo dispersivo continuaria aparecendo uma única banda porém mais espessa.

 Os resultados obtidos por Meselson e Stahl mostraram inequivocamente que, após o 1o ciclo de duplicação, somente uma banda intermediária era visualizada no gradiente de cloreto de césio, em consequência, descartaram imediatamente a hipótese do modo conservativo de duplicação do DNA. No 2o ciclo, encontrava-se uma banda leve e uma pesada, o que eliminava o modo dispersivo de duplicação.

Demonstraram, desta forma que o modo de duplicação da molécula de DNA era semiconservativo o que confirmava a sugestão inicial feita por Watson & Crick. Para J. Cainrs a demonstração feita por Meselson & Stahl foi um dos mais belos experimentos em biologia.

QUE TAL DAR AGORA UMA OLHADINHA NO FLUXO DE INFORMAÇÃO? OU SEJA, COMO AS INSTRUÇÕES CODIFICADAS NA SEQUÊNCIA DOS NUCLEOTÍDEOS SÃO UTILIZADAS PELA CÉLULA?